PCR引物设计八点决窍

（1）引物长度
        引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，zui终影响到 PCR 反应是否成功。多数情况下，引物长度约 18~30bp, 引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。
（2）引物的解链温度
        PCR 反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm 值）。多数 PCR 反应*的 解链温度应在 55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的 Tm 值取决于它的长度、序列组成和浓度，离子强度的影响可以忽略不计，因为不同的 PCR 反应盐浓度变化不大。
        一个反应中所有引物的解链温度应尽可能接近。对于多数 PCR 反应而言，引物之间的差应小于 2~3℃。差值增大，反应效率会降低，甚至直接导致反应失败。因为 Tm 值髙 的引物在低于退火温度的条件下错配，而 Tm 值低的引物在髙于退火温度的条件下与模板只有低浓度结合。
        可利用以zui近邻热力学理论为基础的公式估算 Tm 值，该理论分析了复式解链的热力学过程。
Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）
复式构成物中焓变（△H）和熵变（△S ）可借助于zui近邻热力学参数计算，为摩尔气体常数，c 为寡核苷酸的物质的量浓度。该分析可确定特定的焓和熵对复式构成物的自由能 的影响，该影响由序列中的「zui近邻」造成。zui近邻从 5 末端起始，焓和熵的效应是加性的。在式（1）中加人另一个条件，以经验性地计算盐对复式构成物的稳定性的影响。