TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（石蜡切片）  
Cat  Number：BA2150 
Specification：50 次 
Store at: -20℃ for one year                                                          
MADE BY BIOBOX 
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 (显色法)（石蜡切片） 
一、产品简介 
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便
的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过*标记和后续的 DAB 显色等步骤，即可在普通
光学显微镜检测到凋亡的细胞。 
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提
DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder。基因组DNA 断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧
核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上*(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，
随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，zui后在HRP的催化下通过DAB显色来
显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA
的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细
胞凋亡的原理。 
本试剂盒适用于石蜡包埋组织样本的凋亡原位检测。 
本试剂盒有如下优点： 
1、 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细
胞凋亡。 
2、 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有蛋白酶 K  和DAB。 
3、 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。 
4、 快速：仅需约3个小时即可完成。 
5、 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果，无需贵重设备。 
二、试剂盒组份 
组   份  Cat: BA2120  Cat: BA2150  Cat: BA21100  储存条件 
平衡液  1.0 mL  2.5 mL  5.0 mL  -20℃ 
TdT 酶  80μL  200μL  400μL  -20℃ 
50×蛋白酶 K  40μL  100μL  200μL  -20℃ 
Streptavidin-HRP  10μL  25μL  50μL  4℃避光 
Biotin-dUTP  20μL  50μL  100μL  -20℃ 
DAB  2mg   5mg   10 mg  -20℃避光
三、试剂盒以外自备仪器和试剂 
二甲苯、甲醇、乙醇、PBS、H2O2 
、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等； 
盖玻片、载玻片、染色缸、染色湿盒、光学显微镜、37℃孵箱、移液器等。 
四、保存条件： 
-20℃保存，其中Streptavidin-HRP 4℃保存，Streptavidin-HRP和DAB需避光保存。 
五、注意事项： 
1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时                                                                    
2 
的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生 DNA 断裂的
非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 
2、极少数细胞凋亡时没有 DNA 断裂，此时不适用 TUNEL 法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现 TUNEL
检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，同时检测多个凋亡指标。 
3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 
4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。 
5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 
6、 TdT 酶反应液在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而
产生的试剂损耗。 
7、DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。 
8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 
六、 操作规程 
A、 检测样本的预处理 
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书*的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样 
本材料及试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做
出客观的试验结果。 
1、 对于常规石蜡切片 
a、  按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合 
  （如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、
90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min）） 
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 
c、  把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。 
（蛋白酶K工作液的配制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS） 
d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 
e、  把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。 
（封闭液的配制： 3%H2O2溶于甲醇） 
f、  把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。 
g、 然后转入B步骤标记和显色反应。 
      注意事项： 
a、  蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化
上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及*解决方案》来调整条件。例如：
如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的蛋白酶K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒的50×蛋
白酶K浓度为1mg/mL）。 
b、 其它替代方法：  石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K
处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同： 
替代方法1:                                                                     
3 
 
将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠
檬酸钠，需新鲜配制） 
替代方法2： 
  将脱蜡及水合好的切片浸入*或*中8-10 min（*溶液的配制：
0.25%-0.5%溶于HCl  PH2；*溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl  ） 
替代方法3:  
  将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中
350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨
酸铺片。 
c、  使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。 
2、 对于难处理的石蜡切片 
a、  按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合 
  （如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、
90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min）） 
b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。 
c、  把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W
（）处理1 min。 
d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温， 将组织切片转移至
PBS（20-25℃）中。 
e、  把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。 
 （封闭液的配制：  0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清） 
f、  把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。 
g、 然后转入B步骤标记和显色反应。 
     3、  阳性对照及阴性对照的准备 
TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个
样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。 
        a、 阳性对照样本的准备 
           组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温—37℃处理
10 -30 min，其余步骤均相同。 
（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2,
 
10mM CaCl2） 
b、 阴性对照样本的准备 
在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。 
B、 标记和显色反应： 
1、 预处理好的样本PBS漂洗 2 次，每次5min 后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。 
2、 配制TdT酶反应液：                                                                    
4 
  参考下表配制适当量的 TdT 酶反应液（根据需要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的 TdT
酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。 
  1个样品  5个样品  10个样品 
平衡液  45μl  225μl  450μl 
Biotin-dUTP  1μl  5μl  10μl 
TdT酶  4μl  20μl  40μl 
TdT酶反应液总体积  50μl  250μl  500μl 
3、 每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶） 
4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。 
5、  Streptavidin-HRP及DAB工作液的配制： 
  Streptavidin-HRP工作液的配制： 
参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必须
一次使用完毕，不宜冻存。 
  1个样品  5个样品  10个样品 
Streptavidin-HRP  0.5μl  2.5μl  5μl 
PBS  99.5μl  497.5μl  995μl 
Streptavidin-HRP工作液总体积  100μl  500μl  1000μl 
DAB 工作液的配制： 
a、先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成 20×DAB（10 mg/ml），配制方法如下： 
DAB  2mg  5mg  10mg 
PBS  0.2ml  0.5ml  1.0ml 
  配制成20×DAB（10 mg/ml），放于-20℃保存 
b、DAB工作液的配制： 
参考下表配制适量的DAB工作液，需充分混匀。注意：配制好的DAB工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。  
  1个样品  5个样品  10个样品 
20×DAB（10 mg/ml）  5μl  25μl  50μl 
30％H2O2  1μl  5μl  10μl 
PBS  94μl  470μl  940 
DAB工作液总体积  100μl  500μl  1000μl 
 
6、 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50μL-100μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻
片37℃湿润避光反应30min。 
7、 把第6步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。 
8、 将第7步处理好的样本滴加50μL-100μL DAB工作液，室温孵育5-30分钟或根据显色情况孵育适当时间。
注意：如果显色很强可以短于5分钟即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过
夜。                                                                    
5 
  
9、 把第8步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微镜下观察、拍照。 
10、  选做(本步骤可不做)：用*或甲基绿染色液进行细胞核染色后用光学显微镜下观察、拍照。 
具体的步骤请参照操作注意事项中的苏木素复染 
操作注意事项： 
1、  PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。 
2、 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使
反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。 
3、  TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜*保存，*保存会导酶活性的失活。 
4、 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。 
5、 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色 30min ，蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中 5s，
立即用蒸馏水冲洗干净。分别用 70%、85%、95%、无水乙醇浸泡 5min。用二甲苯浸泡 10min，更换
二甲苯后再浸泡10min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。 
 
七、常见问题的原因及*解决方案 
现象  可能原因  建议 
 
非特异性
染色 
TdT酶的浓度过高  用TdT dilution buffer*  作1︰2—1︰10稀释
TdT 酶反应时间过长或 TdT 酶反应过程中反应液
渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。 
注意控制反应时间，并确保 TdT 酶反应液能
很好地覆盖样品。 
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸
会导致样本DNA的断裂） 
尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 
在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作
用） 
确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注
固定 
使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液  采用*的固定液 
固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA 断裂  用含有dUTP和 dAPT 的溶液封闭 
 
标记率低 
如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因
为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中
丢失） 
用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 
或福尔马林或戊二醛固定。 
固定时间过长，导致交联程度过高 
减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多
聚甲醛固定 
荧光淬灭 
Fluorescence 在普通光照 10 分钟就会严重淬
灭，需注意避光操作 
促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度
过低 
1、 增加通透剂促渗时间 
2、增加通透剂的作用温度（15-25℃） 
3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：
以400ug/ml 作用5min） 
4、0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。 
选择的染料不合适 
用溶于0.1M醋酸*的3-5%甲基绿
PH4.0，或苏木素复染 
染色背景
很高 
支原体污染 
请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支
原体污染 
TdT酶的浓度过高或反应时间过长 
用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释
或注意控制反应时间 
红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。 
高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的
DNA断裂。 
在非高增殖期取样检测 
DAB孵育时间过长  减少DAB染色时间 
Biotin-dUTP的非特异性结合 
在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100
和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 
阳性对照
没有信号 
DNase I的浓度过低 
1、  冷冻切片使用3u/ml的DNase I 
2、  石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I   
3、  一般样本使用10u/ml DNase I 
组织样本
从载玻片
脱落 
组织样本被酶从玻片消化下来  降低蛋白酶K 的处理时间 
6 
*TdT dilution buffer：100mM乙酸钾（pH6.8）， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol