站在共聚焦成像与双光子显微术的上

尼康的A1R MP 是一款拥有独到技术的双光子显微成像系统，不仅具备高分辨率检流计式扫描器（galvanometer scanner），而且还配备了高速共振式扫描器（resonant scanner）。扫描速率在512 X 512像素水平下高达到30帧/秒；在带状扫描模式下可达420帧/秒。新型四通道NDD探测器（non-descanned detectors）具有更高的探测效率、更低的暗电流以及更宽的响应光谱，可以对谱线相近的荧光探针进行实时光谱拆分与识别，并大大提高荧光图像的对比度。此功能对于双光子显微镜非常重要，因为在双光子成像时一般只能使用单一的激发波长，往往不可避免地造成自发荧光以及发射光谱的重叠。


高达420帧/秒成像速率的共振扫描镜    
尼康所*的共振扫描技术，较之于非共振的普通扫描器，大幅提高了宽视场扫描速率，达到了点扫描成像的快速率420帧/秒（512X32）。同时在512X512分辨率下亦可以实现30pfs的成像速度（FOV:18mm）。利用多光子显微术专用的NDD探测器，可以对非常厚的标本进行深部快速成像。尼康的光学同步（optical pixel clock）技术充分保证了超高速图像的均匀性和稳定性。

A1R MP+超高速共振扫描头发出的飞秒脉冲红外激光激发生物体血管内的血细胞，使用3个独立的颜色通道，以30fps速度拍摄的三张连续荧光图像中捕捉到血细胞运动。
箭头表示示踪的白细胞细胞核的移动情况。
三个荧光探针同时被激发，为细胞核 （蓝色）、血管内皮细胞（绿色）和血浆（红色）成像。
长波超快激光与超高速共振扫描头结合使用，能有效减小图像失真，可实现生物分子的时间分辨多光子成像。

图像分辨率512*512像素，图像采集速度：每秒30帧，物镜：水浸物镜60×
合作拍摄者 Satoshi Nishimura 博士，PRESTO，东京大学，TSBMI，心血管医学系，日本科学技术振兴机构提供。Japan Science and Technology Agency提供。







 高灵敏度NDD深部成像      
尼康新开发的多光子四通道NDD探测器能够有效地进行标本深部的显微成像。较普通探测器而言，NDD的感光元件面积更大，灵敏度更高，并安装于距离物镜后出光口（back aperture）最近的地方. 该配置有效地提高了对散射荧光的探测效率，具有更高的信噪比（S/N），对诸如活体组织等较厚的标本的拍摄，具有比普通共聚焦显微镜更为清晰稳定的图像质量。
  

四通道反射NDD                                                                                                              四通道透射NDD

活体小鼠大脑皮层深层成像
用开颅法研究H-line5周龄小鼠的大脑皮层。可从底层到表层看到第五层表达EYFP的椎体神经元的完整树突。此外还研究了更深区域白质中的荧光信号。
左：三维重建图像   
右：z轴叠加图像
         上图：距离表层25μm深度部位的第五层椎体细胞的表层树突
         中图：第五层椎体细胞的基底树突距离表层625μm
         下图：白质中的荧光
激发波长：930nm     物镜：CFI75复消色物镜25×W MP（NA1.10WD2.0）

合作拍摄者：Tomomi Nemoto博士，北海道大学电子科学研究所；Shigenori Nonaka博士，国家基础生物学研究所；Takeshi Lmamura博士，爱媛大学医学研究生院。


小鼠大脑皮层多色成像
使用950nm红外激光对麻醉YFP-H小鼠进行成像，在3个通道中同时分别获取两个荧光信号和二次谐波产生（SHG）信号。
青色：硬脑膜的SHG信号
黄色：EYFP标记的皮层第五层椎体神经元
红色：SRB标记的血管
合作拍摄者：Ryosuke Kawakami博士，Terumasa博士，Tomomi Nemoto博士，北海道大学电子科学研究所。