*分型检测试剂盒

SET A,B,C,D,E

*分型检测试剂盒1．概述

 *分型检测试剂盒SET A，B,C,D,E,采用三明治（夹心）酶联免疫反应法检测固态和液态食品及细菌培养物中的*肠毒素（SET）A，B，C，D，E。

葡萄球菌属于微球菌属。*和猪葡萄球菌可制造一种或多种耐热的肠毒素。这些肠毒素可引致食物中毒。

除沙门氏菌外，*是产生肠毒素并导致食物中毒的主要元凶之一。一般来说，每克食品中5 x 105个产毒素的*可导致中毒。然而，一些研究也显示，仅100 - 200 ng的葡萄球菌肠毒素量便可引致中毒症状。*肠毒素常存于意大利面、肉制成品、奶、奶产品、冰淇淋、蛋类产品、沙拉、面包、蛋糕、馅饼及由这些产品制备而成的其他食品中。其中血清型为A，B，C，D和E 的肠毒素尤为严重。该试剂盒特点包括：

• 简单的前处理方法（离心）。
• 低检测限（0.25ng/ml）。
• 快速的ELISA检测方法（在不考虑样品数量下只需不到3小时）。

*分型检测试剂盒2．试剂盒原理

 *分型检测试剂盒，检测的基础是抗原抗体反应。微孔板A - E孔和H孔包被有针对葡萄球菌肠毒素A，B，C，D和E的特异性抗体。F和G孔包被有针对无免疫动物的抗体（质控）。加入样品溶液至孔A至G（和微孔板架上的标记一致），加入阳性质控至孔H。见附录1。样品溶液中可能含有的毒素会对应的捕获抗体结合。没有结合的部分会在洗涤步骤中被除去。通过加入针对葡萄球菌肠毒素的*酶标记的抗SET抗体酶连接物可以与板上固定结合的肠毒素连接。未连接的酶连接物在洗涤过程中被除去。加入链霉亲和素POD，孵育后洗板。然后加入底物/发色剂。结合在一起的链霉亲和素POD酶连接物将无色发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450/630 ± 10 nm 处测量。吸光度值与样品中的葡萄球菌肠毒素浓度成正比。

1. 试剂盒组成

 本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。

*分型检测试剂盒

4.检测限

5．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料

• 酶标仪(450nm)
• 恒温培养箱
• 匀质器
• 漩涡振荡器
• 微量加样器(10、20、100和1000mL各一支)
• 多道枪：50-300mL

6.注意事项

实验前请阅读以下文字，以保证获得实验效果。

• 阳性质控含有葡萄球菌肠毒素，对健康有危害，因此应避免皮肤接触和滴入口中。
• 所有与阳性质控接触过的材料必须小心处理，被污染的玻璃器皿需要用次氯酸钠（10 %（v/v））浸泡过夜（pH值要用HCl溶液调整至7）。
• 阳性质控还包含叠氮钠，也需特别注意。
• 反应终止液含1 N硫酸
• 保存试剂盒于 2 - 8 °C，不要冷冻。
• 将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封储存于2 - 8 °C条件下。
• 无色发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
• 对过了有效期（见试剂盒外标签有效期）的试剂盒不再提供任何质量保证。
• 若对试剂盒中的反应液进行了稀释，或实验室器材未*清洁，则可能影响本检测的灵敏度。
• 不能交叉使用不同批号的盒中试剂。

7．样品的准备

样品保存在2-4℃不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20℃。样品使用前应恢复到室温。

1）牛奶

• 奶类样品（10 - 25 ml），特别是原奶样品，在低温条件下离心：10 min / 3500 g / 10 °C（若没有条件进行低温离心，则在离心前将样品冷藏降温）。
• *去除（吸取）上层脂肪层 。
• 每孔取100 µl进行检测 。

2）面条和大米（煮好的），肉类、冰激淋、快餐和其他脂肪含量小于40 %的食品样品

•  取10 - 25 g样品粉碎，按照每克样品1.5 ml PBS缓冲液（PH值7.4）的比例进行混合（例如10 g 样品 + 15 ml 缓冲液）
• 振荡15分钟
• 离心：10 min / 3500 g / 10 °C
• 据情况除去上层脂肪
• 每孔取100 µl进行检测

3）脂肪含量大于40 %的食品样品

• 取10 - 25 g样品粉碎，按照每克样品1.5 ml PBS缓冲液（PH值7.4）的比例进行混合（例如10 g 样品 + 15 ml 缓冲液）
• 振荡15分钟
• 离心：10 min / 3500 g / 10 °C
• 取其5 ml上清液于另一离心管中，加入5 ml正庚烷，充分混合5分钟
• 离心：5 min / 3500 g / 10 °C
• *去除上层庚烷层，不能含有任何庚烷残留，将足够用的下层水相转移到另一新的干净试管中
• 每孔取100 µl进行检测

8．酶联免疫反应测试步骤

试剂准备

注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。

1x洗液的制备

1体积的10x洗液同9体积的蒸馏水混合

*分型检测试剂盒检测：

• 将所需数量的微孔板条插到微孔板架上。一个样品需要一整条微孔板条。
• 按微孔板架上的标记向A到G孔里添加100 µl处理好的样品，向H孔里添加100 µl阳性质控。轻轻混匀，覆盖微孔板后，在35 - 37 °C条件下孵育1小时。
• 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证*除去孔中的液体。使用多级移液器向每孔加入300 µl洗涤缓冲液洗涤微孔。上述操作再重复进行四遍。
• 向每一个微孔中加入100 µl酶连接物I溶液，充分混合，覆盖微孔板后，在35 - 37 °C条件下继续孵育1小时。
• 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证*除去孔中的液体。使用多级移液器向每孔加入300 µl洗涤缓冲液洗涤微孔。上述操作再重复进行四遍。
• 向每一个微孔中加入100 µl酶连接物II溶液，充分混合，覆盖微孔板后，在35 - 37 °C条件下继续孵育30分钟。
• 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证*除去孔中的液体。使用多级移液器向每孔加入300 µl洗涤缓冲液洗涤微孔。上述操作再重复进行四遍。
• 向每一个微孔中加入100 µl 底物，充分混合，覆盖微孔板后，在35 - 37 °C条件下继续孵育15分钟。
• 向每一个微孔中加入100 µl 反应终止液，充分混合。在加入反应终止液后30 分钟内于450/630 ± 10 nm 处测量吸光度值。

9. 结果计算

1. 临界值的计算

   计算每个样品F和G孔中的阴性质控的吸光度值平均值。临界值通过平均值加上0.15得到。  

            举例：    阴性质控1（微孔F） = 0.008

                      阴性质控2（微孔G）= 0.010

                  平均值 = 0.009  

                   临界值 = 0.009 + 0.15 = 0.159

 2. 检测质控

         阳性质控的吸光度值应大于或等于1.0。

         阴性质控吸光度值的平均值应小于或等于0.2。

         只有在满足第1和第2点的前提条件下，才应进行结果评估。

 3. 结果分析

      1. 如果样品在450/630 ± 10 nm处的吸光度值小于临界值，为阴性结果。

      2. 如果样品在450/630 ± 10 nm处的吸光度值大于或等于临界值，为阳性结果。

附录I