乳酸脱氢酶检测线说明书

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着 NAD+/NADH 之间互变。
测定原理：

乳酸脱氢酶检测线说明书LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：

提取液：30mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂一：液体 15 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 1.3 mL 蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存；

样品测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。
乳酸脱氢酶检测线说明书测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中加入下列试剂）

试剂名称(μL)    测定管    对照管
样本    50    50
试剂一    250    250
试剂二    50    
蒸馏水        50
充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min
试剂三    250    250
        
充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min
试剂四    750    750

充分混匀，室温静置 3 分钟，450 nm 下测定吸光度，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测
定管需要设一个对照管。

LDH 活力单位的计算：

1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.725x (x 为标准品浓度，umol/mL；y 为对吸光度)。2、血清（浆）LDH 活力的计算单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（nmol/min/mL）=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA

3、细胞、细菌和组织中 LDH 活力的计算（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =92×ΔA÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =92×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（nmol/min/104 cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.046×ΔA

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细胞或细菌总数，2000 万。