化工机械设备网

 

　　光学显微镜作为生命科学、医学和材料科学等领域的核心观测工具。然而受拉格朗日不变量等因素的制约，在传统显微镜中分辨率和成像视场之间存在固有的权衡。随着生物医学领域的基础研究和前沿技术的不断进步，对能够实现跨尺度、高通量显微成像的需求日益增长，但传统显微镜普遍无法兼顾分辨率和视场的双重要求。
 

　　计算光学显微成像技术如合成孔径全息术、傅里叶叠层显微术和无透镜片上显微术等发展迅速，为高通量成像提供了新方案。无透镜片上显微术无需透镜，避免视场与分辨率矛盾，在细胞生物学、病理筛查、药物筛选等领域展现出巨大的应用潜力。但生物细胞和组织的三维结构难以用二维透射率函数表征，光学衍射层析成像技术更适合厚样品。目前，无透镜片上层析成像研究较少，多采用机械光束扫描或多光源阵列照明。倾斜照明会导致衍射图样移位和畸变，大角度照明下数据丢失，影响成像分辨率。因此，如何实现全视场超分辨成像是当前面临的一大挑战。
 

　　针对上述问题，南京理工大学陈钱、左超教授研究团队提出了一种基于波长扫描傅里叶叠层衍射层析技术(wavelength-scanning Fourier ptychographic diffraction tomography，简称wsFPDT)的新型无透镜片上三维显微成像技术，通过波长扫描的照明调控方式实现三维散射势的频谱填充。与基于多角度照明的无透镜三维成像方法相比，该技术不会引入图像移位、畸变等问题，实现了全视场分辨准均匀、无标记、高通量的衍射层析成像。
 

　　图1. 基于wsFPDT无透镜片上三维成像的基本思想。 (a) 光学实验装置示意图。(b) 实验过程示意图。(c) wsFDPT重建原理。

 

　　研究团队搭建了无透镜片上三维衍射层析成像的显微硬件系统(图1a)，采用单色板级传感器记录原始强度图，使用超连续谱光源结合声光可调滤波器进行波长扫描照明。自主开发C++控制软件实现声光可调谐滤波器与传感器同步触发，可在6秒内完成图像采集。然后基于傅里叶叠层重建算法对欠采样的衍射图样重复迭代约束直至收敛，再进行非负约束和全变分正则化相结合的混合约束处理，获得样品像素超分辨的三维折射率分布(图2)。
 

图2. wsFPDT方法重构算法流程图。
 

　　为了验证wsFPDT技术在全视场范围内实现高通量三维成像的能力，对倾斜USAF分辨率靶标进行实验，结果如图3a所示。基于上述系统，wsFPDT获得了775 nm横向分辨率和5.43 μm轴向分辨率，超越CMOS传感器像素尺寸(1.67 μm)采样限制的2.15倍。进一步地，将选定的USAF靶标图案分别水平放置在传感器的中心和边缘位置并重复实验(图3b-c)，可以得到近乎相同的成像结果，表明wsFPDT技术能够提供全视场内准均匀的成像分辨率。此外，倾斜的USAF靶标被悬空放置，致使其离焦距离相较紧贴传感器放置时要远离200 μm以上，这说明wsFPDT方法在不牺牲横向成像分辨率的情况下，能够实现超过200 µm的有效成像深度，该成像深度要比传统的基于透镜的光学衍射层析技术高出5到10倍。图4展示了wsFPDT方法对两种硅藻进行三维重建的结果，从中可以清晰看到硅藻壳的三维骨架结构及其内部复杂的细节信息，该实验进一步证明了wsFPDT方法在处理较厚且具有复杂轴向结构样品的三维层析能力。
 

　　图3.相位分辨率靶标的实验结果。(a) 倾斜放置的分辨率靶标的实验装置设计和重建结果。(b-c) 选定的靶标放置在传感器不同位置的成像结果对比。

 

图4. C. hibernicus和Naviculold两种硅藻的实验结果。
 

　　图5展示了wsFPDT对无标记小鼠单核巨噬细胞高通量三维成像的结果。wsFPDT可以对全视场(29.85 mm2)内所有细胞同时实现定量三维折射率的重建，重建结果包含约18.3亿有效体素，视场范围覆盖约32,000个巨噬细胞。基于所获得的三维折射率分布，可实现对每个细胞的形态学参数(如体积、面积和球形度等)精确的定量分析。实验结果不仅验证了wsFPDT针对大量未染色细胞集群的高通量三维成像方面的能力，还展示了其在单细胞层面进行定量分析的潜力，将为研究细胞的结构特征及其对内部和外部刺激(如渗透压和药物治疗)的反应提供重要的统计数据支持。该方法有望为大规模细胞分析、高内涵精准筛选等方面提供重要的影像学支撑，并在高通量药物研发和无标记病理分析等领域具有重要的应用前景。
 

图5. 小鼠单核巨噬细胞的全视场三维成像。
 

　　上述工作得到了国家重点研发计划(2022YFA1205002, 2024YFE0101300)，基金委国家重大科研仪器研制项目(62227818)，江苏省基础研究计划前沿引领专项(BK20192003)等资助。